ESTUDIO DE LAS ANEMIAS

 Título: prueba de la sacarosa

Fundamento: Consiste en situar los hematíes en un medio de baja fuerza iónica, por lo que tienden a fijar el complemento, teniendo los hematíes, frente a este, una sensibilidad anormalmente alta. En este medio, los hematíes tienden a fijar el complemento y aquellos que son especialmente sensibles se lisan con facilidad. Prueba útil en el diagnóstico de alteraciones en la membrana eritrocitaria.

Reactivos: Solución isotónica de sacarosa (92,4 gr/L). Estable a 4º durante 21 días.

Técnica: 1 tubo con 1.8 ml de suero fisiológico y 0.2 ml de sangre problema / 2 tubo con 1.8 ml se sol. Sacarosa y 0.2 ml sangre control / 3 tubo con 1.8 de sol. De Sacarosa y 0.2 ml de sangre problema.

Mezclar e incubar 30 min a temperatura ambiente

Resultado: comprueba la hemolisis visualmente y se mide el sobrenadante a 540nm ( blanco el tubo SF)

% de hemolisis= ABS del tubo SP/ ABS tubo control X 100

NOTA: el procedimiento esta mal realizado ya que no cogimos el sobrenadante y por lo tanto las absorbancias son mayores 

Título: PRUEBA DE HAM-DICIE (test de adificación del suero)

Fundamento: El complemento es una proteína plasmática que al activarse por el complejo Ag-Ac provoca la lisis celular. Esta acción lítica es favorecida por un descenso del pH del medio (6,5-7) o de la fuerza iónica.

En los hematíes normales, esta acción no aparece ni con el descenso del pH del medio. Solo sucede en la E-HPN (Hemoglobinuria Paroxística Nocturna), en la que aparece hemólisis significativa al acidificar el suero.

Consiste en ver si se produce hemólisis de los hematíes al ser incubados en presencia de suero propio o acidificado. Si realmente se produce se trata de una membranopatía en al que los hematíes presentan una sensibilidad a la acción lítica del complemento.

Materiales: 1º hematíes lavados  y 2º suero del paciente y suero control

Técnica:

- Llenar dos tubos con 0.5 ml se suero paciente y otros tres tubos con 0.5 ml de suero control grupo.

- El tubo 3 se pone al baño maría a 56º durante 30 min., a fin de inactivar el complemento.

- A los tubos 2, 3 y 5 se añaden 0.05 ml de HCl 0,2N a Tª ambiente.

- A todos los tubos se añaden 0.05 ml de una suspensión al 50% de hematíes lavados.

- Se agitan los tubos y se colocan en el baño maría a 37º durante 1h.

- Más tarde se centrifugan y se observa si hay hemólisis en los tubos 2 y 5.

Título: AUTOHEMOLISIS  37ºC

Fundamento: Los hematíes mantienen su integridad molecular gracias a su escaso contenido en ATP, que obtiene exclusivamente a través de la glucólisis. Si por un defecto congénito del metabolismo disminuye la capacidad glucolítica del hematíe, el descenso de ATP producirá un acortamiento de su vida media. Esta prueba tiene como finalidad poner de manifiesto la capacidad de los hematíes para mantener su integridad in Vitro después de un cierto tiempo de incubación.

Reactivos: Solución de glucosa estéril al 10% y Sangre anticoagulada y/o desfibrinada

Técnica:

Tubo                Tubo 1             Tubo 2            Tubo 3             Tubo 4

Glucosa (ml)        -                      -                      0,1                   0,1

Sangre (ml)          2                      2                     2                       2

El resto de sangre se centrifuga para obtener plasma (conservar a 4ºc) que se usará como blanco.

- Incubamos a 37 º los tubos tapados, durante 48 h. (agitamos los tubos a las 24 h.)

- Mezclamos los tubos 1-2 y 3-4.

- Obtenemos el hematocrito de ambos tubos

- Centrifugamos el resto de sangre y con el SOBRENADANTE (PLASMA) preparamos:

Tubo                                            1               2                   3                  4

Sol. NH4OH* al 0,04% (ml)       4,9             4,9              4,9               4,9

Plasma conservado a 4º                0,1            ---              ---                 ---

Plasma con glucosa (3-4)          ----              ----               0,3             ----

Plasma sin glucosa (1-2)            ----              0,1            ----             -----

Sangre total                                  ----             ----           ----              0,1

Se mide a 540nm y calcula la hemolisis 

Abs (tubo 2/3)- VHto (2/3) x 100

% de lisis: ------------------------------------------------------------------ x100

Abs tubo 4 x 20